迪鼠電動車價格表（穴位注射葛根素對布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機制研究）

本文引用：于妍,王春愛,秦曉宇,李玉蘭,梁曦,溫曉輝,劉敏.穴位注射葛根素對布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機制研究[J].中國全科醫學,2022,25(18):2280-2285.DOI:10.12114/j.issn.100

本文引用：于妍, 王春愛, 秦曉宇, 李玉蘭, 梁曦, 溫曉輝, 劉敏. 穴位注射葛根素對布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機制研究[J]. 中國全科醫學, 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

Yan YU, Chunai WANG, Xiaoyu QIN, Yulan LI, Xi LIANG, Xiaohui WEN, Min LIU. Effect and Mechanism of Action of Acupoint Injection of Puerarin on Myocardial Mitochondria Energy metabolism in Bupivacaine-poisoned Rats[J]. Chinese General Practice, 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

穴位注射是在傳統針灸基礎上發展起來的一種療效顯著的中西醫結合療法，其以經絡學說為指導，將腧穴、經絡、藥效有機結合，兼具針刺和藥物的治療作用，具有用藥劑量小、不良反應少的特點，還能大幅度提升臨床療效。近年來穴位注射方法在輔助麻醉及心律失常治療領域上廣泛應用[1,2]。

布比卡因是一種長效的酰胺類局麻藥，因其常規劑量下使用相對安全，且起效快速，常被用于各類手術[3]。然而，過量使用或誤入靜脈仍會導致心律失常、心肌收縮力降低以及循環衰竭從而引發心臟驟停[4]。臨床常用針刺輔助麻醉以減少布比卡因所需劑量，從而避免其不良反應[5]。內關穴是治療心血管疾病的常用穴位之一，刺激內關穴具有抗心律失常、減輕心肌損傷的作用[6]。大量研究表明葛根素具有明顯的心臟保護作用[7]。本研究旨在探討穴位注射葛根素對布比卡因誘導的心肌線粒體結構和功能損傷的影響及其可能的機制。

1　材料與方法

1.1　實驗動物及時間

6月齡SPF級Wistar雄性大鼠40只，體質量（280±20）g，由蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供（SCXK[甘]2019-0002）。本實驗遵循美國國家衛生研究院《實驗動物使用指南》，并經甘肅省中醫院倫理委員會批準（批件號2019-005）。實驗時間為2019年1—12月。

1.2　藥品與試劑

鹽酸布比卡因注射液購自上海朝輝藥業有限責任公司（批號：1404113），葛根素注射液購自成都天臺山制藥有限公司（批號：180201），JC-1試劑盒購自Beyotime公司，大鼠三磷酸腺苷合成酶（ATPase）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自Elab Science公司，三磷酸腺苷（ATP）ELISA試劑盒、Anti-過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）購自Abcam公司，Anti-核呼吸因子（NRF1）、Anti-線粒體轉錄因子A（mtTFA）購自GeneTex公司。

1.3　實驗儀器

鼠控溫解剖臺（眾實迪創科技發展有限公司），微量注射泵（圣諾醫療設備有限責任公司，SN-50F6），多道電生理記錄儀（AD instruments，DBS-170），Power Lab數據采集及分析系統（埃德儀器國際貿易公司），精密電子天平（Sartorius公司），高速冷凍離心機（Sigma公司），-80 ℃超低溫冰箱（Form scientific公司），酶聯免疫檢測儀（Thermo公司）。

1.4　動物分組與給藥方法

采取隨機數字表法將實驗動物分為空白組（C組）、模型組（B組）、治療組（T組）、預防組（P組），每組10只。P組：雙側內關穴分別注入0.1 ml的葛根素注射液。5 min后開始建立布比卡因中毒模型（C組除外），建模方法參照文獻[8,9]，經10%水合三氯乙醛麻醉后，經股靜脈2 min內靜脈滴注0.5%布比卡因10 mg/kg，Ⅱ導聯心電圖出現心律失常（頻發室性期前收縮、室性心動過速、QRS延長20%）表明模型建立成功。將1根套管針置于右側頸動脈以采集血樣及監測動脈血壓，將另1根套管針置于左側股靜脈以術中給藥，并鏈接PowerLab系統；術中持續監測大鼠外周血壓及Ⅱ導聯心電圖。

C組不建模，于雙側內關穴（大鼠前肢內側，離腕關節約3 mm尺橈骨縫間）分別注入0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液。B組：建模成功后即刻取雙側內關穴分別注入0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液。T組：建模成功后即刻取雙側內關穴分別注入0.1 ml葛根素注射液。C組在靜脈滴注0.9%氯化鈉溶液的第8分鐘，B組、T組、P組分別在靜脈滴注利多卡因的第8分鐘處死大鼠，提取所有大鼠左室心肌，分離心肌細胞線粒體。

1.5　指標測定

1.5.1　透射電鏡

實驗結束后對大鼠實施安樂死，并逆行灌注，提取左室心肌，-80 ℃保存。心肌細胞勻漿，冷凍高速離心，2 000 r/min離心10 min（離心半徑5 cm）。取上清液，10 000 r/min離心15 min（離心半徑5 cm），分離心肌細胞線粒體，采用透射電鏡觀察線粒體的結構。

采用Flameng評分法評價線粒體半定量結構，每個電鏡標本隨機選擇若干個視野，對每個視野中的線粒體按此法將線粒體的改變分為5級，并按等級記分；0級（0分）：正常超微結構的線粒體，顆粒完整；Ⅰ級（1分）：結構基本正常，部分顆粒丟失；Ⅱ級（2分）：線粒體腫脹，基質透明；Ⅲ級（3分）：基質透明，線粒體嵴斷裂或基質中出現絮狀凝集；Ⅳ級（4分）：基質丟失，線粒體嵴斷裂，外膜不完整。

1.5.2　ELISA法

采用ELISA法檢測心肌細胞ATPase活性。組織樣品在磷酸鹽緩沖液中勻漿后，離心獲得上清液，37 ℃孵育30 min，用酶標記劑沖洗、孵育、顯色。反應結束后，測量各孔的吸光度，并記錄。

1.5.3　比色法

采用磷鉬酸比色法測定線粒體ATP含量。將心肌組織裂解，4 ℃下12 000×g離心5 min，收集上清液，用分光光度計對樣品進行檢測。

1.5.4　熒光比色法

采用JC-1試劑盒測量線粒體膜電位（MMP）。將1×JC-1工作液按適當比例加入純化的線粒體中，激發波長為458 nm，發射波長為590 nm，用熒光分光光度計對樣品進行檢測。

1.5.5　Western blotting法

心肌組織樣品勻漿后取上清液，分離蛋白，測定總蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，而后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用一抗、二抗在37 ℃下分別孵育1 h，用增強化學發光法獲得Western blotting圖像。采用Image J軟件對靶蛋白條帶進行灰度分析，記錄PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平。

1.6　統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（

±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　不同處理對大鼠心肌線粒體結構的影響

2.1.1　大鼠心肌線粒體結構電鏡觀察

C組大鼠心肌細胞線粒體數量豐富，顆粒完好呈卵圓形，包膜完整，嵴連續；B組大鼠心肌細胞線粒體數量減少、分布不勻，部分線粒體體積變小、形態改變、線粒體膜完整性被破壞，少量線粒體嵴斷裂缺失；T組大鼠心肌細胞線粒體數量略減少，個別線粒體變形、線粒體嵴斷裂缺失；P組大鼠心肌細胞線粒體數量較豐富，顆粒完整，部分線粒體嵴紊亂，無斷裂缺失（圖1）。

2.1.2　大鼠心肌線粒體結構損傷情況

四組大鼠Flameng評分法得分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中B組、T組、P組大鼠Flameng評分法得分高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；P組大鼠Flameng評分法得分低于B組、T組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2　不同處理對心肌線粒體功能障礙的影響

四組大鼠ATPase活性、ATP含量、MMP比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

B組、T組大鼠ATPase活性低于C組、P組，差異有統計學意義（P<0.05）。B組、T組、P組大鼠ATP含量、MMP低于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；T組、P組大鼠ATP含量、MMP高于B組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3　不同處理對心肌線粒體PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達的影響

四組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。B組、T組、P組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；T組、P組大鼠PGC-1α蛋白水平高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）；P組大鼠NRF1蛋白水平高于B組、T組，差異有統計學意義（P<0.05）；T組、P組大鼠mtTFA蛋白水平高于B組，差異有統計學意義（P<0.05）；P組大鼠mtTFA蛋白水平高于T組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3、圖2。

3　討論

布比卡因是臨床工作中廣泛使用的麻醉藥物，但其具有嚴重的心臟毒性。目前，應用最多的解毒方法是使用脂肪乳劑，但同時也存在許多爭議。因此，尋找一種更加安全、有效的救治布比卡因心臟毒性的方法具有重要意義。針灸因其簡便易行、價廉、安全等諸多特點在麻醉領域的應用越來越受到重視，但對于針灸對抗麻醉藥心肌毒性方面的研究還處于起步階段。本課題組前期實驗結果表明穴位處理為治療布比卡因所引起的心臟毒性提供了一定理論依據[9]，但其具體的作用機制還有待進一步研究。近年對于布比卡因心肌毒性的研究主要集中在對線粒體損傷及能量代謝障礙方面，本研究將利用現代分子生物學實驗技術，從亞細胞器水平出發，全面探討穴位預處理對抗布比卡因中毒大鼠心肌線粒體損傷及能量代謝障礙的作用靶點及分子機制，為其臨床應用提供科學依據，為中醫藥防治布比卡因心肌毒性的研究提供新思路。

線粒體通過電子傳遞和氧化磷酸化為真核細胞提供能量[10]，若以上過程發生障礙，則會引起細胞內ATP產量減少。ATP產生一旦減少，呼吸鏈電子漏出的活性氧（ROS）隨即增加，導致MMP降低、通透性轉換孔（MPTP）開放，線粒體內外膜的通透性與完整性發生變化，進而影響其形態結構，形態結構改變后又會加重線粒體的功能異常，形成惡性損傷循環[11]。有研究顯示，布比卡因引起心臟毒性的機制之一是其損傷心肌細胞線粒體的結構和功能。布比卡因可使線粒體的體積增大、數量減少[12]，呈空泡或髓樣改變[13]；還可降低部分線粒體呼吸鏈復合體的活性，導致電子傳遞障礙，影響線粒體能量代謝、產能減少[14,15]，促進線粒體中ROS的產生[16]，但具體的調節機制尚不明確。

PGC-1α是線粒體能量代謝的關鍵因子[17,18,19]，PGC-1α與NRF1結合后，激活mtTFA活性，控制線粒體DNA（mtDNA）的復制與轉錄，調控ATPase等線粒體基因組編碼呼吸鏈亞基的表達。本實驗結果顯示，B組、T組大鼠ATPase活性低于C組，B組、T組、P組大鼠ATP含量、MMP及PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C組，表明布比卡因可抑制PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白的表達，降低ATPase活性，減少ATP合成，使線粒體MMP下降，導致線粒體的結構損害，產生心肌毒性。

既往研究表明，內關穴的心肌保護作用主要通過調節線粒體能量代謝的各種信號來實現[20]。從中藥葛根中分離的葛根素通過靶向作用線粒體亦顯示出對心肌的保護作用[21]。本課題組前期實驗結果表明，內關穴注射葛根素減輕布比卡因導致大鼠心臟毒性的機制與其增加心肌組織中的乳酸脫氫酶（LDH）活性、增加Na+-K+-ATPase活性、調節線粒體能量代謝有關[22]。本研究結果顯示，P組大鼠ATPase活性高于B組、T組，T組、P組大鼠ATP含量、MMP高于C組；T組、P組大鼠PGC-1α蛋白水平高于B組，P組大鼠NRF1蛋白水平高于B組、T組，T組、P組大鼠mtTFA蛋白水平高于B組，P組大鼠mtTFA蛋白水平高于T組；表明通過穴位注射葛根素可以逆轉布比卡因造成的線粒體結構及功能損傷，保護心肌細胞，且注入布比卡因前預先穴位注射葛根素對線粒體的調節作用明顯優于注入布比卡因出現心律失常后再穴位注射葛根素。但因本實驗未設立相關蛋白分子的激動劑和抑制劑組，所以難以得出因果關系，這也是今后本課題組進一步研究的方向。

綜上所述，穴位注射葛根素可減輕布比卡因致心肌線粒體損傷，可能與其調節PGC-1α/NRF1/mtTFA信號轉導通路、保護線粒體能量代謝、減輕線粒體結構損傷有關，具體調節機制尚待進一步研究。

本文無利益沖突。

本文部分圖表略

參考文獻略

穴位注射葛根素對布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機制研究